Characterizing the eukaryotic queuosine salvage pathway and advancing tRNA modification detection through nanopore sequencing and reverse transcription error profiling

tRNAs decodieren mRNAs und ermöglichen eine präzise Proteinsynthese, die durch zahlreiche Nukleotidmodifikationen reguliert wird. Queuosin ist eine konservierte Modifikation an der Wobble-Position (34) bestimmter tRNAs. Durch die Anpassung des Gleichgewichts zwischen Watson-Crick- und Wobble-Basenpaarung verbessert es die Codonerkennung, erhöht die Translationsgeschwindigkeit und unterstützt die zelluläre Homöostase. Sein Verlust ist mit Defekten in Stressreaktionen, der Mitochondrienfunktion und Krebs verbunden. Da Eukaryoten Queuosin nicht de novo bilden, beziehen sie Queuin oder Queuosin über einen Recyclingweg aus Nahrung oder Darmmikrobiota. Lange waren zentrale Elemente dieses Weges unbekannt. Diese Studie identifiziert zwei essenzielle Komponenten: einen Transmembrantransporter, der Queuin und Queuosin importiert, sowie eine Queuosin-Nukleosid-Glycosylase, die Queuin aus Queuosin freisetzt. Zusammen mit der tRNA-Guanin-Transglycosylase, die Queuin an Position 34 einsetzt, ergibt sich ein deutlich erweitertes Bild des eukaryotischen Recycling- und Einbausystems. Zur Analyse weiterer tRNA-Modifikationen wurde Nanoporen-Direkt-RNA-Sequenzierung eingesetzt. Sie misst Ionenstromänderungen, während native RNA eine Pore passiert, und ermöglicht so den direkten Nachweis von Modifikationen ohne Reverse Transkription oder PCR. Mithilfe modifikationssensitiver Dorado-v5.2.0-Basecalling-Modelle wurden mehrere Modifikationen – Ψ, Um, m5C, Cm, I, m6A, Am und Gm – untersucht. Bereiche mit hoher Modifikationsdichte, wie etwa die Anticodon-Schleife, bleiben jedoch schwer aufzulösen. Ergänzend wurde eine spezialisierte Reverse Transkriptase RT-KTq I614Y eingesetzt, die charakteristische Fehlersignaturen erzeugt, um m2A an Position 37 in E. coli-tRNAAsp und tRNAHis nachzuweisen. Diese Ergebnisse erweitern das Verständnis des Queuosin-Recyclingwegs und zeigen, wie Nanoporensequenzierung und RT-Fehlereinbau gemeinsam komplexe tRNA-Modifikationsmuster aufdecken können. ; tRNAs decode mRNAs and ensure accurate assembly of ...