Contributors: Laboratoire de Recherche en Sciences Végétales (LRSV); Université Toulouse III - Paul Sabatier (UT3); Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS); Génomique et Biotechnologie des Fruits (GBF); École nationale supérieure agronomique de Toulouse (ENSAT, INP-ENSAT, AgroToulouse, INP-AgroToulouse); Institut National Polytechnique (Toulouse) (Toulouse INP); Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Institut National Polytechnique (Toulouse) (Toulouse INP); Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’Alimentation et l’Environnement (INRAE); LRSV-Régulation et Dynamique de la Formation du Bois (LRSV-RDFB); Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)-Université Toulouse III - Paul Sabatier (UT3); Mer, molécules et santé EA 2160 (MMS); Le Mans Université (UM)-Université de Nantes - UFR des Sciences et des Techniques (UN UFR ST); Université de Nantes (UN)-Université de Nantes (UN)-Université de Nantes - UFR des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques (UFR SPB); Université de Nantes (UN)-Université de Nantes (UN); Toulouse Biotechnology Institute (TBI); Institut National des Sciences Appliquées - Toulouse (INSA Toulouse); Institut National des Sciences Appliquées (INSA)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Institut National des Sciences Appliquées (INSA)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)-Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’Alimentation et l’Environnement (INRAE); ANR-10-LABX-0041,TULIP,Towards a Unified theory of biotic Interactions: the roLe of environmental(2010); ANR-11-IDEX-0002,UNITI,Université Fédérale de Toulouse(2011)
Abstract: International audience ; Eucalypts are the most planted hardwoods worldwide. The availability of the Eucalyptus grandis genome highlighted many genes awaiting functional characterization, lagging behind because of the lack of efficient genetic transformation protocols. In order to efficiently generate knockout mutants to study the function of eucalypts genes, we implemented the powerful CRISPR/Cas9 gene editing technology with the hairy roots transformation system. As proofs-of-concept, we targeted two wood-related genes: Cinnamoyl-CoA Reductase1 (CCR1), a key lignin biosynthetic gene and IAA9A an auxin dependent transcription factor of Aux/IAA family. Almost all transgenic hairy roots were edited but the allele-editing rates and spectra varied greatly depending on the gene targeted. Most edition events generated truncated proteins, the prevalent edition types were small deletions but large deletions were also quite frequent. By using a combination of FT-IR spectroscopy and multivariate analysis (partial least square analysis (PLS-DA)), we showed that the CCR1-edited lines, which were clearly separated from the controls. The most discriminant wave-numbers were attributed to lignin. Histochemical analyses further confirmed the decreased lignification and the presence of collapsed vessels in CCR1-edited lines, which are characteristics of CCR1 deficiency. Although the efficiency of editing could be improved, the method described here is already a powerful tool to functionally characterize eucalypts genes for both basic research and industry purposes.
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