ATF3 -activated accelerating effect of LINC00941/lncIAPF on fibroblast-to-myofibroblast differentiation by blocking autophagy depending on ELAVL1/HuR in pulmonary fibrosis

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est caractérisée par une cicatrisation pulmonaire et n'a pas de traitement efficace. La différenciation des fibroblastes en myofibroblastes et la prolifération et la migration des myofibroblastes sont des manifestations cliniques majeures de cette maladie ; par conséquent, le blocage de ces processus est une stratégie de traitement pratique. Ici, il a été constaté que LINC00941/lncIAPF hautement régulé accélère la fibrose pulmonaire en favorisant la différenciation fibroblaste-myofibroblaste et la prolifération et la migration des myofibroblastes. Le dosage de la chromatine accessible à la transposase à l'aide d'expériences de séquençage et d'immunoprécipitation de la chromatine a permis d'élucider que l'acétylation de l'histone 3 lysine 27 (H3K27ac) activait l'ouverture de la région chromosomique dans le promoteur LINC00941. En conséquence, le facteur de transcription ATF3 (activating transcription factor 3) s'est lié à cette région, et la transcription de LINC00941 a été améliorée. L'isolement par affinité de l'ARN, l'immunoprécipitation de l'ARN (RIP), la RNase-RIP, l'analyse de demi-vie et les expériences d'ubiquitination ont révélé que LINC00941 formait un complexe ARN-protéine avec ELAVL1/HuR (ELAV like RNA binding protein 1) pour exercer sa fonction pro-fibrotique. La technologie de surveillance des adénovirus à double fluorescence mRFP-GFP-MAP1LC3/LC3 (chaîne légère 3 de la protéine 1 associée aux microtubules), le réseau PCR du profiler RT2 de l'autophagie humaine et le flux autophagique ont révélé que l'axe LINC00941 -ELAVL1 inhibait la fusion des autophagosomes avec un lysosome. Les expériences ELAVL1 RIP-seq, RIP-PCR, mRNA stability, and rescue ont montré que lecomplexe LINC00941 -ELAVL1 inhibait l'autophagie en contrôlant la stabilité des gènes cibles EZH2 (enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit), STAT1 (signal transducer and activators of transcription 1) et FOXK1 (forkhead box K1). Enfin, l'effet thérapeutique de LINC00941 a été confirmé dans un modèle murin et chez des patients atteints de FPI. Ce travail fournit une cible thérapeutique et une nouvelle stratégie thérapeutique efficace liée à l'autophagie pour la FPI. Abréviations : ACTA2/a-SMA : actine alpha 2, muscle lisse ; ATF3 : activating transcription factor 3 ; ATG : autophagy related ; Baf-A1 : bafilomycine A1 ; BLM : bléomycine ; CDKN : cyclin-dependent kinase inhibitor ; CLN3 : CLN3 lysosomal/endosomal transmembrane protein, battenin ; COL1A : collagen type I alpha ; COL3A : collagen type III alpha ; CXCR4 : C-X-C motif chemokine receptor 4 ; DRAM2 : DNA damage regulated autophagy modulator 2 ; ELAVL1/HuR : ELAV like RNA binding protein 1 ; EZH2 : enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit ; FADD : Fas associated via death domain ; FAP/FAPα : protéine alpha d'activation des fibroblastes ; FOXK1 : boîte à fourchette K1 ; CVF : capacité vitale forcée ; GABARAP : protéine associée au récepteur GABA de type A ; GABARAPL2 : protéine associée au récepteur GABA de type A comme 2 ; IGF1 : facteur de croissance analogue à l'insuline 1 ; IPF : fibrose pulmonaire idiopathique ; LAMPE : protéine membranaire associée au lysosome ; lncRNA : ARN long non codant ; MAP1LC3/LC3 : protéine associée au microtubule 1 chaîne légère 3 ; NPC1 : transporteur intracellulaire de cholestérol NPC 1 ; RGS : régulateur de la signalisation de la protéine G ; RPLP0 : sous-unité P0 de la tige latérale de la protéine ribosomale ; roc : caractéristique de fonctionnement du récepteur ; S100A4 : protéine A4 de liaison au calcium SQSTM1/p62 : séquestosome 1 ; STAT1 : transducteurs de signaux et activateurs de la transcription 1 ; TGFB1/TGF-β1 : facteur de croissance transformant bêta 1 ; TNF : facteur de nécrose tumorale ; UIP : pneumonie interstitielle habituelle ; ULK1 : unc-51 comme la kinase activant l'autophagie 1 ; VIM : vimentine.
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) se caracteriza por la cicatrización pulmonar y no tiene un tratamiento eficaz. La diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos y la proliferación y migración de miofibroblastos son las principales manifestaciones clínicas de esta enfermedad; por lo tanto, el bloqueo de estos procesos es una estrategia de tratamiento práctica. Aquí, se descubrió que LINC00941/lncIAPF altamente regulado al alza acelera la fibrosis pulmonar al promover la diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos y la proliferación y migración de miofibroblastos. El ensayo de cromatina accesible a la transposasa utilizando experimentos de secuenciación e inmunoprecipitación de cromatina aclaró que la acetilación de histona 3 lisina 27 (H3K27ac) activó la apertura de la región cromosómica en el promotor LINC00941. Como consecuencia, el factor de transcripción ATF3 (factor de transcripción activador 3) se unió a esta región y se mejoró la transcripción de LINC00941. El aislamiento de afinidad de ARN, la inmunoprecipitación de ARN (RIP), la RNasa-RIP, el análisis de semivida y los experimentos de ubiquitinación revelaron que LINC00941 formó un complejo de ARN-proteína con ELAVL1/HuR (proteína de unión a ARN similar a ELAV 1) para ejercer su función profibrótica. La tecnología de monitoreo de adenovirus de doble fluorescencia mRFP-GFP-MAP1LC3/LC3 (cadena ligera 3 de proteína 1 asociada a microtúbulos), la matriz de PCR perfiladora RT2 de autofagia humana y el flujo autofágico revelaron que eleje LINC00941-ELAVL1 inhibió la fusión de autofagosomas con un lisosoma. Los experimentos de ELAVL1 RIP-seq, RIP-PCR, estabilidad de ARNm y rescate mostraron que el complejo LINC00941-ELAVL1 inhibió la autofagia al controlar la estabilidad de los genes diana EZH2 (potenciador de la subunidad 2 del complejo represivo polycomb zeste 2), STAT1 (transductor de señales y activadores de la transcripción 1) y FOXK1 (caja forkhead K1). Finalmente, se confirmó el efecto terapéutico de LINC00941 en un modelo de ratón y en pacientes con FPI. Este trabajo proporciona una diana terapéutica y una nueva estrategia terapéutica eficaz relacionada con la autofagia para la FPI. Abreviaturas: ACTA2/a-SMA: actina alfa 2, músculo liso; ATF3: factor de transcripción activador 3; ATG: relacionado con la autofagia; Baf-A1: bafilomicina A1; BLM: bleomicina; CDKN: inhibidor de cinasa dependiente de ciclina; CLN3: proteína transmembrana lisosomal/endosomal CLN3, battenina; COL1A: colágeno tipo I alfa; COL3A: colágeno tipo III alfa; CXCR4: receptor de quimiocina de motivo C-X-C 4; DRAM2: modulador de autofagia regulado por daño al ADN 2; ELAVL1/HuR: proteína de unión a ARN similar a ELAV 1; EZH2: potenciador de la subunidad 2 del complejo represivo polycomb de zeste 2; FADD: Fas asociado a través del dominio de muerte; FAP/FAPα: proteína alfa de activación de fibroblastos; FOXK1: caja forkhead K1; FVC: capacidad vital forzada; GABARAP: proteína asociada al receptor GABA tipo A; GABARAPL2: proteína asociada al receptor GABA tipo A como 2; IGF1: factor de crecimiento similar a la insulina 1; IPF: fibrosis pulmonar idiopática; LAMP: proteína de membrana asociada a lisosomas; lncRNA: ARN largo no codificante; MAP1LC3/LC3: proteína asociada a microtúbulos 1 cadena ligera 3; NPC1: transportador de colesterol intracelular NPC 1; RGS: regulador de la señalización de la proteína G; RPLP0: subunidad del tallo lateral de la proteína ribosomal P0; Roc: característica operativa del receptor; S100A4: proteína de unión al calcio S100 A4; SQSTM1/p62: secuestosoma 1; STAT1: transductores de señal y activadores de la transcripción 1; TGFB1/TGF-β1: factor de crecimiento transformante beta 1; TNF: factor de necrosis tumoral; UIP: neumonía intersticial habitual; ULK1: quinasa activadora de autofagia tipo unc-51; VIM: vimentina.
Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is characterized by lung scarring and has no effective treatment. Fibroblast-to-myofibroblast differentiation and myofibroblast proliferation and migration are major clinical manifestations of this disease; hence, blocking these processes is a practical treatment strategy. Here, highly upregulated LINC00941/lncIAPF was found to accelerate pulmonary fibrosis by promoting fibroblast-to-myofibroblast differentiation and myofibroblast proliferation and migration. Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing and chromatin immunoprecipitation experiments elucidated that histone 3 lysine 27 acetylation (H3K27ac) activated the chromosome region opening in the LINC00941 promoter. As a consequence, the transcription factor ATF3 (activating transcription factor 3) bound to this region, and LINC00941 transcription was enhanced. RNA affinity isolation, RNA immunoprecipitation (RIP), RNase-RIP, half-life analysis, and ubiquitination experiments unveiled that LINC00941 formed a RNA-protein complex with ELAVL1/HuR (ELAV like RNA binding protein 1) to exert its pro-fibrotic function. Dual-fluorescence mRFP-GFP-MAP1LC3/LC3 (microtubule associated protein 1 light chain 3) adenovirus monitoring technology, human autophagy RT2 profiler PCR array, and autophagic flux revealed that the LINC00941-ELAVL1 axis inhibited autophagosome fusion with a lysosome. ELAVL1 RIP-seq, RIP-PCR, mRNA stability, and rescue experiments showed that the LINC00941-ELAVL1 complex inhibited autophagy by controlling the stability of the target genes EZH2 (enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit), STAT1 (signal transducer and activators of transcription 1) and FOXK1 (forkhead box K1). Finally, the therapeutic effect of LINC00941 was confirmed in a mouse model and patients with IPF. This work provides a therapeutic target and a new effective therapeutic strategy related to autophagy for IPF. Abbreviations: ACTA2/a-SMA: actin alpha 2, smooth muscle; ATF3: activating transcription factor 3; ATG: autophagy related; Baf-A1: bafilomycin A1; BLM: bleomycin; CDKN: cyclin dependent kinase inhibitor; CLN3: CLN3 lysosomal/endosomal transmembrane protein, battenin; COL1A: collagen type I alpha; COL3A: collagen type III alpha; CXCR4: C-X-C motif chemokine receptor 4; DRAM2: DNA damage regulated autophagy modulator 2; ELAVL1/HuR: ELAV like RNA binding protein 1; EZH2: enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit; FADD: Fas associated via death domain; FAP/FAPα: fibroblast activation protein alpha; FOXK1: forkhead box K1; FVC: forced vital capacity; GABARAP: GABA type A receptor-associated protein; GABARAPL2: GABA type A receptor associated protein like 2; IGF1: insulin like growth factor 1; IPF: idiopathic pulmonary fibrosis; LAMP: lysosomal associated membrane protein; lncRNA: long noncoding RNA; MAP1LC3/LC3: microtubule associated protein 1 light chain 3; NPC1: NPC intracellular cholesterol transporter 1; RGS: regulator of G protein signaling; RPLP0: ribosomal protein lateral stalk subunit P0; ROC: receiver operating characteristic; S100A4: S100 calcium binding protein A4; SQSTM1/p62: sequestosome 1; STAT1: signal transducers and activators of transcription 1; TGFB1/TGF-β1: transforming growth factor beta 1; TNF: tumor necrosis factor; UIP: usual interstitial pneumonia; ULK1: unc-51 like autophagy activating kinase 1; VIM: vimentin.
يتميز التليف الرئوي مجهول السبب بتندب الرئة وليس له علاج فعال. التمايز بين الخلايا الليفية إلى الخلايا الليفية العضلية وانتشار الخلايا الليفية العضلية والهجرة هي مظاهر سريرية رئيسية لهذا المرض ؛ وبالتالي، فإن منع هذه العمليات هو استراتيجية علاج عملية. هنا، تم العثور على LINC00941/lncIAPF عالي التنظيم لتسريع التليف الرئوي من خلال تعزيز تمايز الأرومة الليفية إلى الأرومة الليفية العضلية وتكاثر الأرومة الليفية العضلية وهجرتها. أوضح فحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه من خلال الترانسبوزيز باستخدام تجارب التسلسل والترسيب المناعي للكروماتين أن هيستون 3 ليسين 27 الأستلة (H3K27ac) قام بتنشيط فتحة منطقة الكروموسوم في معزز LINC00941. ونتيجة لذلك، تم تعزيز عامل النسخ ATF3 (تنشيط عامل النسخ 3) المرتبط بهذه المنطقة، ونسخ LINC00941. كشف عزل تقارب الحمض النووي الريبي، والترسيب المناعي للحمض النووي الريبي (RIP)، و RNase - RIP، وتحليل نصف العمر، وتجارب الانتشار أن LINC00941 شكلت مركب بروتين الحمض النووي الريبي مع ELAVL1/HUR (ELAV مثل بروتين ربط الحمض النووي الريبي 1) لممارسة وظيفتها المؤيدة للتليف. كشفت تقنية مراقبة الفيروسات الغدية ثنائية الفلورة mRFP - GFP - MAP1LC3/LC3 (البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1 السلسلة الخفيفة 3)، ومصفوفة تفاعل البوليميراز المتسلسل للبلعمة الذاتية البشرية RT2، والتدفق الذاتي البلعمة أن محور LINC00941 - ELAVL1 يثبط اندماج البلعمة الذاتية مع الليزوزوم. أظهرت تجارب ELAVL1 RIP - seq و RIP - PCR واستقرار الحمض النووي الريبوزي المرسال وتجارب الإنقاذ أن معقد LINC00941 - ELAVL1 يثبط الالتهام الذاتي من خلال التحكم في استقرار الجينات المستهدفة EZH2 (محسن معقد زيست 2 بولي كومب القمعي 2 وحدة فرعية)، STAT1 (محول الإشارة ومنشطات النسخ 1) و FOXK1 (صندوق رأس الشوكة K1). أخيرًا، تم تأكيد التأثير العلاجي لـ LINC00941 في نموذج الفأر والمرضى الذين يعانون من IPF. يوفر هذا العمل هدفًا علاجيًا واستراتيجية علاجية فعالة جديدة تتعلق بالالتهام الذاتي من أجل IPF. الاختصارات: ACTA2/a - SMA: الأكتين ألفا 2، العضلات الملساء ؛ ATF3: تنشيط عامل النسخ 3 ؛ ATG: ذات صلة بالبلعمة الذاتية ؛ BAF - A1: بافيلوميسين A1 ؛ BLM: بليوميسين ؛ CDKN: مثبط كيناز معتمد على السيكلين ؛ CLN3: بروتين الغشاء الليزوزومي/الجسيمي CLN3، الباتينين ؛ COL1A: كولاجين من النوع الأول ألفا ؛ COL3A: كولاجين من النوع الثالث ألفا ؛ CXCR4: مستقبل كيموكين C - X - C 4 ؛ DRAM2: مضمن البلعمة الذاتية المنظم بتلف الحمض النووي 2 ؛ ELAVL1/HuR: ELAV مثل بروتين ربط الحمض النووي الريبي النووي الريبي 1 ؛ EZH2: محسن من ZEST 2 معقد قمع السلائل 2 ؛ FADD: FAS المرتبط بالموت عبر المجال ؛ FAP/FAP: بروتين تنشيط الأرومة الليفية ألفا ؛ FOXK1: صندوق الشوكة K1 ؛ FVC: السعة الحيوية القسرية ؛ GABARAP: بروتين مرتبط بمستقبلات GABA من النوع A ؛ GABARAPL2: بروتين مرتبط بمستقبلات GABA من النوع A مثل 2 ؛ IGF1: عامل نمو يشبه الأنسولين 1 ؛ IPF: تليف رئوي مجهول السبب ؛ المصباح: بروتين غشاء مرتبط بالليزوسومات ؛ lncRNA: رنا طويل غير مشفر ؛ MAP1LC3/LC3: بروتين مرتبط بالأنابيب الدقيقة 1 سلسلة خفيفة 3 ؛ NPC1: ناقل الكوليسترول داخل الخلايا NPC 1 ؛ RGS: منظم إشارات بروتين G ؛ RPLP0: بروتين ريبوسومي ساق جانبي P0 ؛ ROC: خاصية تشغيل المستقبل ؛ S100A4: S100 بروتين ربط الكالسيوم A4 ؛ SQSTM1/p62: سكيستوم 1 ؛ STAT1: محولات الإشارات ومنشطات النسخ 1 ؛ TGFB1/TGF - β 1: تحويل عامل النمو بيتا 1 ؛ TNF: عامل نخر الورم ؛ UIP: الالتهاب الرئوي الخلالي المعتاد ؛ ULK1: un -51 مثل البلعمة الذاتية التي تنشط الكيناز 1 ؛ VIM: فيمنتين.