Die Funktion von Munc-18 in der Exozytose sekretorischer Granulen

Die Calcium-abhängige Freisetzung von Neurotransmitter aus sekretorischen Organellen wird durch eine Reihe konservierter Proteinfamilien präzise reguliert. Hierzu zählen u.a. SNARE-Proteine (soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein (SNAP) receptor ), Rab-GTPasen und SM-Proteine. SNARE-Proteine sind membranständige Proteine, deren gemeinsames Merkmal das 60-70 Aminosäuren umfassende SNARE-Motiv ist. SNARE-Proteine können sich spontan und irreversibel zu einem Vier-Helix-Bündel ( core complex ) zusammenlagern. Die Komplexbildung zwischen SNAREs auf Vesikelmembran und Plasmamembran führt zu einer Verkürzung der Proteine. Hierdurch werden die Membranen einander angenähert, was die Voraussetzung für die Membranfusion darstellt. Die funktionelle Bedeutung von SNARE-Proteinen für die Membranfusion wird durch die Vergiftung von Zellen mit den clostridialen Neurotoxinen Tetanustoxin und Botulinustoxin deutlich, die einzelne SNAREs proteolytisch spalten und die Neurotransmission hemmen. Das synaptische SM-Protein Munc-18-1 bindet hochaffin an das SNARE-Protein Syntaxin1. Hierbei konkurriert die Bindung von Munc-18-1 an Syntaxin1 mit dessen Einbindung in den core complex . Dies führte zu einem Modell, demzufolge Munc-18-1 durch seine Bindung an Syntaxin1 eine inhibitorische Rolle in der Exozytose übernimmt. Eine rein inhibitorische Funktion von Munc-18-1 läßt sich jedoch nicht mit seinem essentiellen Charakter für die Membranfusion in allen Spezies vereinbaren. Diese zentrale Rolle des Proteins im Membranfusionsvorgang ist jedoch weitgehend unverstanden. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der Interaktion zwischen Munc-18-1 und Syntaxin1 für die Exozytose von sekretorischen Granulen neuroendokriner Zellen in einem kombinierten Ansatz aus biochemischen und elektrophysiologischen Methoden untersucht. Die Interaktion zwischen Syntaxin1 und Munc-18-1 wurde gestört, indem zum einen Munc-18-1 überexprimiert wurde und zum andern in die Syntaxin1-Bindungsregion des Munc-18-1-Moleküls Punktmutationen eingeführt wurden (D34N und R39C). Nach der biochemischen Dokumentation der Störung der Syntaxin1-Bindung wurden die Mutanten sowie das Wildtyp- (WT-) Protein in der neuroendokrinen Zellinie PC12 überexprimiert und die Folgen der Überexpression mit Hilfe der Kohlefaser-Amperometrie elektrophysiologisch charakterisiert. Die Überexpression des Munc-18-WT-Proteins hatte keinen Effekt, was eine inhibitorische Funktion des Proteins unwahrscheinlich macht. Die R39C-Mutante wies eine gewisse Restbindung an Syntaxin1 auf, wohingegen die Bindung der D34N-Mutante an Syntaxin1 vernachlässigbar war. Trotz dieser gleichsinnig veränderten Syntaxin1-Bindung hatten die Mutanten gegensätzliche Effekte auf die Häufigkeit exozytotischer Ereignisse: die Zahl exozytotischer Ereignisse war durch R39C vermindert und durch D34N erhöht. Dies wies auf die Beteiligung eines weiteren Munc-18-1-Bindungspartners an den beobachteten Effekten hin, woraufhin die Interaktion von Mint1 mit Munc- 18-WT,-D34N und-R39C charakterisiert wurde. Mint1 ist ein synaptisches Multidomänen-Protein mit Phosphotyrosin-Bindungsdomänen sowie PDZ-Domänen, die die Interaktion mit weiteren präsynaptischen Proteinen vermitteln und Mint1 somit in die vielfältigen Protein-Interaktionen der Präsynapse einbetten. Die Beobachtung, daß bei gleichzeitiger Anwesenheit von Syntaxin1 und Mint1 die D34N-Mutante und die R39C-Mutante unterschiedliche Proteininteraktionen bevorzugten (Mint1/Munc-18-Komplex, bzw. Munc-18/Syntaxin1-Komplex), führte zu der Hypothese, daß der stimulatorische Effekt der D34N-Mutante durch die beobachtete gehäuft auftretende Interaktion mit Mint1 verursacht wird. Eine elektrophysiologische Charakterisierung des Mint1-Proteins in PC12-Zellen zeigte, daß Mint1 eine Inhibition der Exozytose verursacht. Die stimulierende Wirkung der D34N-Mutante könnte somit auf eine vermehrte Interaktion mit Mint1 zurückzuführen sein und eine Disinhibition darstellen. Die R39C-Mutante entfaltete ihre inhibitorische Wirkung vermutlich über die abgeschwächte Syntaxin1-Bindung. Zusammengefaßt hat Munc-18-1 eine positive Funktion in der LDCV-Exozytose. Zudem beschränkt sich die Rolle von Munc-18-1 nicht auf seine Interaktion mit Syntaxin1. Munc-18-1 ist über die Interaktion mit Mint1 vermutlich in vielfältige präsynaptische Komplexe involviert und könnte während der Membranfusion ein entscheidendes Bindeglied zwischen der Membranfusionsmaschinerie und strukturgebenden Komponenten der Präsynapse darstellen.
Calcium-dependent neurotransmitter release from secretory vesicles is a highly regulated process involving several evolutionary conserved protein families. These include SNARE-proteins (soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein (SNAP) receptor), Rab GTPases as well as the family of cytosolic SM proteins. SNARE proteins are membrane-anchored proteins possessing a characteristic stretch of 60-70 amino acids termed the SNARE motif . Specific combinations of SNARE proteins are able to assemble into highly stable complexes of four parallel ?-helices via their SNARE motives, forming the so-called core complex . The assembly of SNAREs of vesicular and plasma membranes pulls the membranes in close apposition, a prerequisite for subsequent membrane fusion. The importance of SNARE proteins for membrane fusion becomes obvious when cells are poisoned with clostridial neurotoxins as Tetanus toxin or Botulinum toxin that cleave SNARE proteins proteolytically, eventually leading to the inhibition of neurotransmission. The synaptic SM protein munc-18-1 has been originally identified by its high affinity interaction with the plasma membrane SNARE protein syntaxin1. The observation that binding of munc-18-1 to syntaxin1 precludes the formation of the core complex contributed substantially to the idea that munc-18 acts as an inhibitor of exocytosis by regulating the availability of syntaxin1 for SNARE complexes. Still, this does not explain why munc-18-1 is essential for membrane fusion. Thus, although munc-18-1 has a central role in membrane fusion, its precise function is little understood. In this study, the role of the munc-18-1/syntaxin1 interaction in exocytosis of secretory granules in neuroendocrine cells was investigated. To this end, a combined biochemical and electrophysiological approach was chosen. The munc-18-1/syntaxin1 interaction was perturbed by overexpressing wildtype munc-18-1 protein and by introducing point mutations into the syntaxin-binding region of munc-18-1. Syntaxin-binding of the mutants was analysed biochemically in several binding assays followed by overexpression of the mutant proteins as well as the wildtype-protein in the neuroendocrine cell line PC12. The effects of overexpression were subsequently characterised by carbon fibre amperometry. Overexpression of munc-18-WT protein did not affect exocytosis, making an inhibitory function of munc-18-1 in exocytosis unlikely. The point mutants used (munc-18-D34N and R39C) showed a differentially reduced syntaxin1 binding. R39C still showed binding to syntaxin1, while D34N could not be detected in a complex with syntaxin1. Surprisingly, although both mutants had a reduced syntaxin1 binding ability, their effects on exocytosis were opposite: R39C caused a decrease in the number of exocytotic events, while D34N caused an increase. This pointed towards the involvement of a further munc-18-1 binding partner. Thus, we characterised the interaction of munc-18-WT, -D34N, and R39C with Mint1. Mint1 is a synaptic multidomain protein possessing a phosphotyrosine binding domain (PTB domain) as well as two PDZ domains that bind to further presynaptic proteins connecting Mint1 to numerous presynaptic protein complexes. The observation that in the presence of syntaxin1 and Mint1, the preferred protein complex of D34N is different from the one preferred by R39C (Mint1/Munc-18 complex and Munc-18/syntaxin1 complex, respectively) led to the hypothesis that the stimulatory effect of the D34N mutant is caused by the more frequent interactions with Mint1 that were observed in this study. The electrophysiological characterization of Mint1 overexpression in PC12 cells showed an inhibitory effect. Thus, the stimulating effect of the D34N mutant may be explained by more frequent interactions with inhibitory Mint1 causing a disinhibition. In contrast, the R39C-mutant presumably exerts its effects via its perturbed syntaxin1-binding. This study shows that munc-18-1 is not an inhibitory factor in exocytosis. Munc- 18-1 s function in exocytosis is not limited to its interaction with syntaxin1. It can be involved in numerous protein interactions at the synapse via its interaction with Mint1 and may represent an important link between the membrane fusion machinery via syntaxin1 and proteins organising the release site via Mint1.