Abstract: Dendritische Zellen (DCs) bilden die Brücke zwischen angeborener und adaptiver Immunantwort und spielen eine wichtige Rolle bei der Induktion einer Anti-Tumor Antwort. Allerdings ist ihre Ausreifung im Tumormikromilieu gestört, was zu einem unreifen Phänotyp und verminderter Immunkompetenz führt. Die Entstehung regulatorischer DCs im Tumormikromilieu ist einer der Gründe, wieso maligne Tumoren sich einer Erkennung durch das Immunsystem entziehen können („tumor immune escape“) und die Erfolgsrate immunologischer Therapien (wie z.B. Checkpoint Inhibitoren) verringert wird. Obwohl die Forschung auf diesem Gebiet voranschreitet, sind die Mechanismen der Induktion regulatorischer DCs im Tumormikromilieu nur teilweise verstanden. Neben der Induktion regulatorischer dendritischer Zellen gilt auch die Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) als ein typisches Kennzeichen maligner Zellen und spielt eine entscheidende Rolle beim „tumor immune escape“. Allerdings ist mittlerweile auch bekannt, dass Tumoren selbst die Expression antioxidativer Enzyme hochregulieren, um sich der Schädigung durch ROS und der H2O2-induzierten Apoptose zu entziehen. ROS spielen außerdem auch eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen Stoffwechselvorgängen. Zum Beispiel setzen monozytäre Zellen beim sogenannten „respiratory burst“ Superoxid-Radikale und Wasserstoffperoxid (H2O2) frei, welche für die Phagozytose von Pathogenen essentiell sind. In vorangegangenen Studien konnte gezeigt werden, dass die Depletion von Wasserstoffperoxid (H2O2) durch exogene oder stromal exprimierte Catalase die Induktion immunsuppressiver myeloider Suppressorzellen (MDSCs) aus humanen Monozyten zur Folge hat. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das empfindliche Gleichgewicht von ROS im Tumormikromilieu eine wichtige Rolle bei der Vermittlung einer Anti-Tumor-Antwort spielt. In dieser Arbeit konnte ein bisher unbekannter Zusammenhang zwischen H2O2 und der Ausreifung von Monozyten zu funktionellen, dendritischen Zellen aufgedeckt werden. Die Catalase-vermittelte Depletion von H2O2 während der Differenzierung und Ausreifung humaner dendritischer Zellen führte zur Induktion unreifer DCs (CAT-DCs) mit geringerer Expression wichtiger dendritischer Reifungsmarker, insbesondere der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86. Diese CAT-DCs zeigten im Vergleich zu normal ausdifferenzierten DCs ein geringeres Potential allogene PAN T-Zellen zu stimulieren. Zudem waren sie in der Lage, die T-Zell Proliferation in einem kontaktabhängigen, Indolamin-2,3-dioxygenase-vermittelten Mechanismus zu unterdrücken. Außerdem zeigten mit CAT-DCs kokultivierte T-Zellen eine Erhöhung der IL-10 und IL-17-Produktion. Diese IL-10/IL-17-produzierenden T-Zellen spielen unter anderem eine Rolle bei der Ausbildung eines immunsuppressiven Tumormikromilieus bei AML Patienten. Auch die Depletion von H2O2 mittels Glutathionperoxidase (GPX) konnte die Expression von CD80 und CD86 verringern, was die Rolle von H2O2 als entscheidendes Substrat hervorhebt. Durch die erhöhte Expression von IL-6, IL-8, PAI-1 und CXCL1 wiesen CAT-DCs zum Teil Merkmale von Tumor-assoziierten M2 Makrophagen auf. Zudem ließ sich eine adhärente Subpopulation mit gesteigerter CD163 Expression abgrenzen, wie sie ebenfalls bei Tumor-assoziierten M2-Makrophagen zu beobachten ist. Des Weiteren wiesen CAT-DCs eine niedrigere Fas Rezeptor Expression und reduzierte Apoptoserate auf, was sich auf die Depletion von Apoptose-induzierendem H2O2 zurückführen lässt – ein Mechanismus, den sich auch Tumorzellen zunutze machen. Interessanterweise führte die extrazelluläre Depletion von H2O2 zu einer gesteigerten intrazellulären de-novo H2O2 Produktion. Dies unterstreicht die Komplexität der Auswirkungen der extrazellulären H2O2 Depletion auf intrazelluläre Prozesse. Außerdem zeigten CAT-DCs eine höhere Aufnahme von sog. Low-density Lipoprotein (LDL) und oxidiertem LDL (oxLDL). Die Inhibition des LDL-Rezeptors und LRP1 (LDL receptor-related protein 1) führte wiederum zu einer verringerten Induktion suppressiver DCs, waseinen bisher unbekannten Zusammenhang zwischen H2O2, gesteigerter LDL Aufnahme und der Bildung regulatorischer DCs aufzeigt. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Ausreifung und Funktionalität dendritischer Zellen durch Depletion von H2O2 mittels Catalase stark beeinträchtigt wird. Die lokale, extrazelluläre H2O2-Depletion führt hierbei zu einer gesteigerten intrazellulären H2O2-Produktion. Die gesteigerte Aufnahme von LDL konnte als Mechanismus identifiziert werden, der diese Beeinträchtigung steuert. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass CAT-DCs in der Lage sind, die T-Zell-Antwort in einem kontaktabhängigen, IDO-vermittelten Mechanismus zu supprimieren. Zusätzlich waren CAT-DCs nicht nur in der Lage, die T-Zell Antwort zu supprimieren, sondern auch die Polarisation der T-Zellen hin zu einem suppressiven IL-17/IL-10 Phänotyp zu verändern. Der in dieser Arbeit ermittelte Einfluss von H2O2 auf die Ausreifung und Funktionalität dendritischer Zellen unterstreicht die Bedeutung von ROS in der Tumorimmunologie und kann als Ansatzpunkt zur Entwicklung zukünftiger Therapiestrategien dienen. Dendritic cells (DCs) are key players in the initiation and maintenance of immune responses against pathogens and malignant cells but their function is often impaired in the tumor microenvironment, also known as tumor immune escape. Reactive oxygen-species (ROS) play a pivotal role in tumor immune escape as they have been demonstrated to impair immunological tumor-rejection resulting in uncontrolled tumor progression. However, tumors themselves express increased levels of antioxidant enzymes to escape H2O2-mediated apoptosis and cell damage. This study demonstrates a link between ROS and DC maturation, with H2O2 as a critical molecule for function and differentiation of DCs. Incubation of human monocytes with the H2O2-depleting enzyme catalase during DC-differentiation and maturation (CAT-DCs) resulted in impaired expression of common maturation markers, especially costimulatory molecules CD80 and CD86. CAT-DCs proved to be functional in suppressing T cell proliferation in a contact-dependent, IDO-mediated manner. Moreover, CAT-DCs were able to skew T cell polarization to an immunosuppressive phenotype with increased IL-10 and IL-17 expression which has been reported in AML patients, previously. Since H2O2-depletion by glutathione peroxidase led to impaired upregulation of CD80 und CD86 as well, H2O2 could be identified as the responsible substrate. CAT-DCs exhibited an altered cytokine profile with increased expression of IL-6, IL-8, PAI-1 and CXCL1, which is indicative of a tumor-associated M2 macrophage phenotype. Interestingly, extracellular depletion of H2O2 resulted in increased intracellular H2O2 production, highlighting the extensive effects of extracellular H2O2-depletion on intracellular processes. Inhibition of LDL uptake led to reduced immunosuppressive properties of CAT-DCs, suggesting that targeting their increased lipid metabolism is a possible clinical target to combat altered differentiation and reduced immune competence of DCs in the tumor microenvironment. This study identified a link between tumor metabolism, reactive oxygen species and the induction of a tumor immune response by dendritic cells which should be taken into account when developing new anti-cancer therapies.
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